Mathilde Lecourt and Sylvain Antoniotti*

Université C?te d’Azur, CNRS

Institut de Chimie de Nice

Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France.

E-mail: sylvain.antoniotti@univ-cotedazur.fr

摘要：白色生物技術(shù)已出現(xiàn)在生物化學(xué)制造過(guò)程中，以提供滿足社會(huì)對(duì)天然、環(huán)保負(fù)責(zé)和可持續(xù)材料新興趣的香料成分。因此，在這些主題上開(kāi)展了激烈的研發(fā)活動(dòng)，導(dǎo)致科技論文和專(zhuān)利申請(qǐng)報(bào)告了生物催化、代謝工程、合成生物學(xué)、生物合成闡明、基因編輯和克隆以及分析化學(xué)中最先進(jìn)方法的組合。在這篇小型綜述中，我們從過(guò)去6年的科學(xué)文章和專(zhuān)利調(diào)查中挑選了一系列新穎的生物技術(shù)工藝和成分，并從化學(xué)、可持續(xù)性和自然性方面進(jìn)行了分析。一方面，對(duì)代謝工程進(jìn)行分類(lèi)，并允許精油替代物或單分子成分的生物技術(shù)合成，另一方面，通過(guò)對(duì)天然復(fù)雜物質(zhì)的化學(xué)成分進(jìn)行特定和選擇性的酶改性，對(duì)其化學(xué)組成進(jìn)行修改。

自2000年以來(lái)，出現(xiàn)了許多涉及生物催化的方法，以從數(shù)量或質(zhì)量上改善香料中使用的精油和天然提取物。在這方面，主要使用纖維素酶、果膠酶和糖苷酶對(duì)植物材料進(jìn)行預(yù)處理以提高提取或蒸餾產(chǎn)量，以促進(jìn)揮發(fā)性分子從細(xì)胞隔層中釋放。隨著范式的重大轉(zhuǎn)變，一些作者開(kāi)始研究在后處理過(guò)程中直接對(duì)天然復(fù)合物混合物（如精油和天然提取物）使用生物催化，而化學(xué)家通常傾向于對(duì)純物質(zhì)使用生物催化。[1]然而，該領(lǐng)域的范圍和復(fù)雜性最近有所增加。不僅在前處理和后處理方法中使用了新的酶，而且在工業(yè)中發(fā)現(xiàn)并實(shí)施了新的生物技術(shù)和工藝。這就是新類(lèi)型成分的誕生，例如通過(guò)代謝工程獲得的生物技術(shù)成分，無(wú)論是作為生物生產(chǎn)的精油還是純化合物。它們是在生物反應(yīng)器中由來(lái)自金合歡基二磷酸或葡萄糖等簡(jiǎn)單碳源的重組微生物產(chǎn)生的。[2] 因此，有高度的生物資源（一般高達(dá)100%），并與其傳統(tǒng)的自然對(duì)應(yīng)物密切相關(guān)。隨著過(guò)去二十年來(lái)分子生物學(xué)的進(jìn)步和許多物種基因組的測(cè)序，現(xiàn)在可以從野生天然來(lái)源（細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物等）中選擇編碼所需酶的基因，并將其轉(zhuǎn)移到重組生物體中，通常為大腸桿菌或曲霉屬。。如果多個(gè)編碼不同酶的基因被轉(zhuǎn)移，宿主的代謝可以被修改，從而產(chǎn)生相對(duì)大量的有價(jià)值的產(chǎn)品，其化學(xué)復(fù)雜性取決于組裝的生物合成步驟的數(shù)量。代謝途徑，有時(shí)來(lái)自不同物種，可以混合或重建，使生物合成完全或部分可以從簡(jiǎn)單的前體進(jìn)行。最后，基因可以可以隨機(jī)或選擇性地進(jìn)行修改，以提高生物工藝的性能：產(chǎn)量、體積生產(chǎn)率、對(duì)映體選擇性、底物范圍、溫度耐受性等…

代謝工程與一類(lèi)新的配料

在本節(jié)中，我們將查閱有關(guān)使用重組生物體的科學(xué)文獻(xiàn)和許多專(zhuān)利，這些利用重組生物表達(dá)基因編碼植物中涉及生物合成氣味分子的酶，主要是萜烯類(lèi)和萜類(lèi)化合物，但不僅僅是萜類(lèi)。這些經(jīng)過(guò)改性的有機(jī)體可以用來(lái)生產(chǎn)精油等效物或單分子。

新型天然復(fù)合混合物

廣藿香Pogostemon cablin

廣藿香油主要成分的生物合成途徑已被深入研究，可能最重要的發(fā)現(xiàn)是，盡管廣藿香精油中存在化學(xué)多樣性（大部分為倍半萜烴），[3]實(shí)際上有少量萜烯合成酶在起作用，并占這種多樣性的重要部分。[4] 特別是，發(fā)現(xiàn)了編碼多功能倍半萜合酶的單一廣藿香醇合酶cDNA，可從大腸桿菌中異源表達(dá)，通過(guò)his標(biāo)記技術(shù)純化，并用于以金合歡基、香葉基和橙花基二磷酸為底物的生物催化反應(yīng)。如果(E,E)-金合歡基二磷酸（FPP）被環(huán)化為(E,E)-吉馬二烯基陽(yáng)離子和愈創(chuàng)木酰陽(yáng)離子，則形成了廣藿香精油中的幾種重要倍半萜，如（-）-廣藿香醇、塞舌爾烯、α-、β-和γ-廣藿香烯、α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯（dguaiene）（方案1）。

方案1.一次起始環(huán)化反應(yīng)所得倍半萜烴的化學(xué)多樣性。氫化物位移可以是1,2-或1,3-位移。W-M代表Wagner-Meerwein。

因此，使用單一的天然起始材料，如(E,E)-金合歡基二磷酸，可以生產(chǎn)廣藿香精油倍半萜烯和倍半萜的混合物，從而進(jìn)入一類(lèi)與蒸餾成分具有化學(xué)和感官相似性的新型生物技術(shù)成分。

瑞士F&F公司Firmenich&Cie提交了多項(xiàng)專(zhuān)利，成分Clearwood?于2014年推出，是一種相當(dāng)于廣藿香精油的“純凈”產(chǎn)品，[6]通過(guò)可持續(xù)工藝獲得，具有供應(yīng)穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。[7] 其天然等級(jí)受到質(zhì)疑，[8]這不僅是因?yàn)樵讷@得珍貴倍半萜烯混合物的過(guò)程中使用了轉(zhuǎn)基因生物，還因?yàn)榇嬖趶V藿香醇乙醚，該物質(zhì)未列入廣藿香精油130種已公布的成分中，之前在自然界中也未被鑒定。[9]

同樣，表達(dá)廣藿香醇合成酶變體的重組大腸桿菌菌株已成功用于從(E,E)-金合歡基二磷酸生產(chǎn)廣藿香醇和一些相關(guān)倍半萜。[10] 觀察到廣藿香精油化合物，但有趣的是，還使用(2Z,6E)-和(2E,6Z)-金合歡基二磷酸測(cè)試了酶反應(yīng)的立體特異性。前者主要提供α-和γ-古蕓烯和大香葉烯B，后者提供未知的倍半萜烯（C15H24）和蠕蟲(chóng)大香葉烷。兩者都不能轉(zhuǎn)化為廣藿香醇，即C2-C3和C6-C7位的碳碳雙鍵不同立體化學(xué)導(dǎo)致了E,E異構(gòu)體以外的其他碳離子中間體。對(duì)于香葉基和橙花基二磷酸，形成檸檬烯、α和去磷酸化萜烯醇的混合物。

Akigalawood?是最近與廣藿香油合作推出的另一種新型生物技術(shù)成分。這一種目前是奇華頓的專(zhuān)屬配料。[11] 專(zhuān)利中明確提到它是一種含有莎草奧酮的材料。[12]莎草奧酮是一種有氣味的倍半萜類(lèi)物質(zhì)，存在于多種天然產(chǎn)品中，尤其是紅葡萄酒中，具有辛辣、木香的嗅覺(jué)感受。[13] 已闡明了葡萄中α-愈創(chuàng)木烯的生物合成，并鑒定了相關(guān)基因。[14]

奇華頓最近的一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)中提到，利用表達(dá)葡萄和廣藿香倍半萜合成酶的重組微生物從金合歡基二磷酸生產(chǎn)α-愈創(chuàng)木烯和莎草奧酮，以及沉香屬（agarwood）的氧化酶。[15] 該專(zhuān)利提到微生物可以在體內(nèi)從糖中生產(chǎn)金合歡基二磷酸，但該特定點(diǎn)未在所有權(quán)中列出。在另一系列專(zhuān)利中，提出了一種酶法從α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯中提取莎草奧醇的方法。[16] 它基于漆酶的使用，在存在或不存在化學(xué)介質(zhì)（例如1-羥基苯并三唑）的情況下，并特別指出起始的倍半萜烯可以被廣藿香精油的輕餾分所取代，這些輕餾分通常含有不同比例的α、β和δ-愈創(chuàng)木烯、塞舌爾烯和β、δ-廣藿香烯?？紤]到漆酶的已知反應(yīng)性，通過(guò)α-愈創(chuàng)木烯的直接烯丙基氧化形成莎草奧醇后，很可能在其他氧化產(chǎn)物中也會(huì)獲得莎草奧酮（方案2）。[17]

銀杏生物工程公司最近提交的一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)描述了通過(guò)使用由稀有或滅絕植物（如野木槿屬、大花白楊屬、長(zhǎng)毛錦雞兒屬、托葉錦雞兒屬、虎杖屬，和溫特迪亞狹葉屬）核酸序列組裝而成的嵌合萜烯合成酶，形成倍半萜烯和倍半萜類(lèi)化合物，包括愈創(chuàng)木烯及其衍生物。[18]

方案二. 將α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯轉(zhuǎn)化為莎草奧醇和莎草奧酮。

檀香木（檀香屬）

檀香油是另一種重要的木本天然成分，它是通過(guò)水蒸氣蒸餾檀香木心而獲得的。東印度的品質(zhì)來(lái)源于檀香。檀香通常產(chǎn)于印度尼西亞和斯里蘭卡，最近在西澳大利亞北部的種植園中也有種植。[19] 檀香油主要由倍半萜烯醇組成，其中(Z)-α-檀香醇和（Z）-β-檀香醇占80-90%。公認(rèn)這些檀香醇也是檀香香氣的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，歸因于(+)-(Z)-α-檀香醇和(-)-(Z)-β-檀香醇對(duì)映體。最近的生物合成研究揭示了一種常見(jiàn)的倍半萜合酶在檀香屬植物中的作用，它可以將金合歡基二磷酸轉(zhuǎn)化為α-和β-檀香烯、反式β-香檸檬烯、表-β-檀香烯和(Z)-β-金合歡烯。[20] 通過(guò)P450單加氧酶對(duì)α-和β-檀香烯的前-(Z)甲基進(jìn)行化學(xué)選擇性羥基化，形成檀香的芳香倍半萜醇。[21]通過(guò)在重組細(xì)胞中克隆這些基因，可以工業(yè)化實(shí)施發(fā)酵過(guò)程，以提供2020年5月推出的Dreamwood?配料（方案3）。[22]

方案3. 由檀香屬植物倍半萜合酶（SS）將金合歡基二磷酸生物轉(zhuǎn)化為α-和β-檀香烯混合物，然后通過(guò)P450單加氧酶進(jìn)行化學(xué)選擇性羥基化。

重組生物產(chǎn)生的純分子

降龍涎醚Ambrox

降龍涎醚是一種倍半萜類(lèi)化合物，有許多商標(biāo)名（Ambroxide?、Ambroxan?、Ambrofix?、Ambermox?、Ambermor?、Ambrox?super）。這是動(dòng)物原料龍涎香的氣味原理，龍涎香是抹香鯨（Physetter macrocephalus）的一種病理性分泌物。

開(kāi)發(fā)了可行的合成路線，來(lái)避免道德、經(jīng)濟(jì)和供應(yīng)問(wèn)題。二萜二醇-雪松酚的半合成已建立，該化合物是制造鼠尾草精油（Salvia sclarea）的副產(chǎn)品。然而，由于鼠尾草精油的穩(wěn)定和適度消費(fèi)以及降龍涎醚的大量和日益增加的使用，這種耦合制造工藝不能滿足對(duì)雪松醇的需求。通過(guò)生物合成克隆鼠尾草中的雙（香葉基）二磷鹽所涉及的兩種酶后，產(chǎn)生共表達(dá)成團(tuán)泛球菌和雙（香葉基）二磷鹽以及兩種二萜合成酶的工程可獲得大腸桿菌菌株（方案4）。[23]因此，從30 g/L甘油作為碳源開(kāi)始，形成高達(dá)1.5 g/L的雪松醇，以及15%的13-表-香紫蘇醇。隨后進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化研究，包括代謝工程。[24]

方案4. 雙（香葉基）二磷鹽制備的香葉醇和降龍涎醚。

同樣，也可以從表達(dá)煙草（Nicotiana glutinosa）的賴(lài)百當(dāng)醇合成酶和香紫蘇醇合成酶的重組微生物中生產(chǎn)香紫蘇醇，并通過(guò)各種已知反應(yīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為降龍涎醚。[25]

通過(guò)(E)-β-金合歡烯得到龍涎呋喃Ambrofix?

生物技術(shù)公司Amyris成功開(kāi)發(fā)了利用改性酵母的生物技術(shù)制造工藝，生物基(E)-β-金合歡烯已成為一種商品化學(xué)品。在釀酒酵母中，(E)-β-金合歡烯通過(guò)黃花蒿金合歡烯合酶的異源表達(dá)由金合歡基二磷酸(FPP)產(chǎn)生?？山邮艿纳a(chǎn)力要求金合歡烯合酶的異源表達(dá)和內(nèi)源性甲羥戊酸途徑酶的過(guò)度表達(dá)，以持續(xù)向酵母提供金合歡基二磷酸(FPP)。從培養(yǎng)液中分離出來(lái)的高濃度(E)-β-金合歡烯可被釀酒酵母所耐受，從而具有良好的生產(chǎn)力（對(duì)于100 g葡萄糖，高達(dá)23.8 g（(E)-β-金合歡烯）。[26](E)-β-金合歡烯因此可以通過(guò)末端雙鍵的化學(xué)選擇性和立體特異性環(huán)丙烷化，然后在水中通過(guò)Bronsted酸催化開(kāi)環(huán)，分兩步化學(xué)轉(zhuǎn)化為(E,E)-均金合歡醇。[28](E,E)-均金合歡醇然后通過(guò)角鯊烯-霍普烯環(huán)化酶（SHC）酶環(huán)化為(-)-龍涎呋喃(Ambrofix?)，該酶可由微生物分離或異源表達(dá)（方案5）。[29]可以通過(guò)隨機(jī)誘變優(yōu)化產(chǎn)自酸乳桿菌的SHC，表達(dá)SHC變體的大腸桿菌菌株，使高達(dá)188 g/L(E,E)-均金合歡醇在SDS作為表面活性劑存在的最小72小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化。[30]

方案5.(E,E)-均金合歡醇通過(guò)角鯊烯-霍普烯環(huán)化酶（SHC）環(huán)化成(-)-龍涎呋喃。

同樣，巴斯夫的一項(xiàng)專(zhuān)利提到了一種均金合歡醇龍涎香烷環(huán)化酶，它可以從檸檬醛中得到(-)-降龍涎醚?。[31]

龍涎縮醛(amber oxepin)（又名amberketal）商標(biāo)為Z11?[32]，在生物技術(shù)香料成分組合中是獨(dú)一無(wú)二的，因?yàn)樗畛跏?0年代發(fā)現(xiàn)的一種人工成分，當(dāng)時(shí)進(jìn)行大量的合成工作來(lái)完成的龍涎香致香分子。龍涎縮醛可從香紫蘇醇、淚杉醇或香紫蘇醇氧化物中發(fā)酵得到，然后經(jīng)過(guò)清潔氧化和縮醛生成。因此，它是以生物為基礎(chǔ)的，過(guò)程是可持續(xù)的，但不能被認(rèn)為是自然的。

深冬烯Zizaene

香根草精油是通過(guò)對(duì)海地、印度尼西亞、巴西、留尼汪島或斯里蘭卡的香根草進(jìn)行水蒸餾而獲得的，是一種珍貴的天然成分，具有木香、壤香、琥珀香的香氣。分析化學(xué)家認(rèn)為它是使用的香料中最復(fù)雜的天然物質(zhì)之一。[33]香根草精油中的幾種氣味影響成分具有共同的深冬烷骨架，例如深冬酮、深冬醇、深冬-3-醇、和表-2-深冬烯-6(13)-烯-3-酮，見(jiàn)（方案6）。[34]

參與香根草中的(+)-深冬烯萜烯合酶已與甲羥戊酸鹽途徑相關(guān)的基因一起轉(zhuǎn)移到重組大腸桿菌中。[35]因此，可以提出將葡萄糖的工程化全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化為(+)-深冬烯。改性大腸桿菌菌株在兩相DNB發(fā)酵液/異辛烷中進(jìn)行發(fā)酵，并在優(yōu)化條件下輸送高達(dá)25 mg/L(+)-深冬烯（由10%的β-菖蒲二烯形成），初始進(jìn)料為5 g/L葡萄糖。

最近獲得了一項(xiàng)專(zhuān)利，可通過(guò)發(fā)酵進(jìn)一步經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)有機(jī)合成得到5-表-β-香根草酮和相關(guān)致香成分，從而獲得豆腐柴螺二烯（一種螺旋二烯倍半萜）。[36] β-香根草酮是一種具有螺癸烷骨架的成分，是香根草精油香氣中的一種貢獻(xiàn)成分，具有果香和木香香氣。

方案6. 來(lái)自參考文獻(xiàn)[34]，香根草精油中發(fā)現(xiàn)的具有深冬烷骨架的香氣影響分子

諾卡酮Nootkatone

含氧倍半萜諾卡酮是香根草和柑橘精油的一種成分，在葡萄柚香氣方面起著重要作用，通常與乙酸香根草酯有關(guān)。[34]巴倫西亞橙（Citrus x sinensis Valencia）精油中的倍半萜碳?xì)浠衔锿邆愊┛赏ㄟ^(guò)化學(xué)選擇性氧化得到諾卡酮。一個(gè)編碼瓦倫烯合成酶的基因可在重組細(xì)菌細(xì)胞中異源表達(dá)，并允許通過(guò)濃度高達(dá)356 g/L的金合歡醇二磷酸從碳源（如葡萄糖）生產(chǎn)瓦倫烯。[37]（生物）化學(xué)氧化可將瓦倫烯轉(zhuǎn)化為諾卡酮，已知酶反應(yīng)可選擇性地提供所需的異構(gòu)體（方案7）。[38]

最近，月桂烯等單萜烯烴也吸引了生物技術(shù)公司的興趣。[39]從羅勒屬植物和香葉基二磷酸鹽中克隆出一種月桂烯合酶，從冬青櫟、大冷杉、金魚(yú)草、擬南芥、粗山羊草屬植物、石蒜科六出花或歐洲云杉中克隆出一種香葉基二磷酸合酶，并在微生物重組有機(jī)體中表達(dá)，以產(chǎn)生月桂烯，以及其他萜烯，如α-和γ-萜烯，來(lái)自碳源，如單糖（如葡萄糖）、雙糖（如蔗糖）或不可發(fā)酵碳源（甘油）。雖然月桂烯本身在嗅覺(jué)上并不引人關(guān)注，但生物基月桂烯可以轉(zhuǎn)化為各種有價(jià)值的產(chǎn)品，從而部分或完全生物基化。

方案7. 從葡萄糖到諾卡酮的生物催化途徑。

在另一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)中聲稱(chēng)，用編碼整個(gè)甲羥戊酸途徑的基因和所選萜烯合酶轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞可將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為香茅醛和香茅醇。[40]

麝香酮Muscone

除萜烯類(lèi)外，還利用重組生物制備了麝香酮等大環(huán)化合物，動(dòng)物原料麝香、麝香酮和麝香酮的氣味原理。[41]L-異亮氨酸被用作前體，為甲基取代的不對(duì)稱(chēng)碳原子提供了正確的絕對(duì)構(gòu)型。在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化為(S)-2-氧代戊酸-3-甲酯。

轉(zhuǎn)酮酶活性傳遞(S)-2-甲基丁醛，進(jìn)一步氧化為(S)-2-甲基丁酸，硫酯化為(S)-2-甲基丁酸輔酶A。

然后，后者通過(guò)脂肪酸合成酶結(jié)合到(S)-反異脂肪酸生物合成中，導(dǎo)致14、16或18個(gè)碳原子鏈。末端位置的氧化產(chǎn)生相應(yīng)的二元酸，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其二元酸輔酶A并環(huán)化為麝香酮，可能通過(guò)環(huán)縮合/水解/脫羧（方案8）。

方案8. (R)-麝香酮的多步生物催化合成。

(Z)-3-己烯-1-醇(Z)-hex-3-en-1-ol

草青香氣中的典型致香分子為(Z)-3-己烯-1-醇。開(kāi)發(fā)了一種從亞麻酸（來(lái)自大豆粉）中提取13-脂氧合酶（LOX）和13-過(guò)氧化氫裂解酶（HPL）的生物技術(shù)方法，以獲得(Z)-3-己烯-1-醛，進(jìn)一步還原為(Z)-3-己烯-1-醇。通過(guò)定向進(jìn)化提高了從番石榴（番石榴）中分離的13-過(guò)氧化氫裂解酶的性能。經(jīng)過(guò)四個(gè)周期的基因改組和隨機(jī)突變，預(yù)期的產(chǎn)品產(chǎn)量增加了15倍。[42]

檀香醇Santalol

繼對(duì)桑塔烯合酶的研究（見(jiàn)上文）之后，巴斯夫于2020年7月收購(gòu)Isobionics后向市場(chǎng)提供了一種可再生的生物技術(shù)桑塔洛爾。[43]

食用香料Flavors

由生物技術(shù)生產(chǎn)的天然等級(jí)的食用香料在市場(chǎng)上存在時(shí)間比香水中的日用香料成分要長(zhǎng)。

因此，考慮到天然香蘭素與合成香蘭素相比的市場(chǎng)價(jià)格以及供應(yīng)的不穩(wěn)定性，生物技術(shù)生產(chǎn)的天然香蘭素，無(wú)論是在全細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中還是在分離酶中，仍然是一個(gè)熱門(mén)目標(biāo)。[44]從天然和可用的起始材料，如阿魏酸[45]、丁香酚[46]、和姜黃素，開(kāi)發(fā)了幾種路線。[47]經(jīng)過(guò)多種酶工程的重組微生物現(xiàn)在能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為香蘭素和香蘭素β-D-葡萄糖苷，后者對(duì)微生物毒性較小。[48]其他帶有水果香氣的天然香料，如呋喃酮（草莓香氣）和羥苯基丁酮（覆盆子香氣），是最近研究開(kāi)發(fā)可行生物技術(shù)路線的重點(diǎn)。

用分離酶優(yōu)化天然復(fù)合物

如果整個(gè)細(xì)胞過(guò)程對(duì)于多步合成和明顯的從頭合成特別有效，當(dāng)只需要一個(gè)反應(yīng)來(lái)轉(zhuǎn)化現(xiàn)成的起始材料時(shí)，分離酶可能是更好的選擇。固定化技術(shù)有很多種，酶可以附著在幾乎任何類(lèi)型的載體上（有機(jī)、礦物、疏水、親水、天然、合成、磁性……），允許其回收和再循環(huán)或在連續(xù)過(guò)程中使用。[51]另一方面，考慮到酶的底物特異性，它們已被用于與天然復(fù)合物（NCS）中單一化合物或有限數(shù)量的常見(jiàn)化學(xué)類(lèi)別的化合物反應(yīng)。因此，可以通過(guò)對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行受控、特定和選擇性的酶改性來(lái)優(yōu)化天然復(fù)合物的性質(zhì)。

香根草精油Vetiver essential oil

香根草精油（VEO）是一種重要的天然香料原料（見(jiàn)上文）。市場(chǎng)上可以找到幾種來(lái)源，也可以找到幾種特別產(chǎn)物，如具有某些特定嗅覺(jué)特征的分子蒸餾餾分、乙酰化衍生物或兩者的組合。富含倍半萜醇的粗香根草精油或分餾香根草精油確實(shí)可以進(jìn)行乙?；磻?yīng)，以提供各種質(zhì)量的乙酸香根草酯。乙酸香根草酯是一種仍然屬于木香家族的致香成分，但具有琥珀和葡萄柚的香氣，壤香較少。

乙酸香根草酯通常是通過(guò)在催化劑存在或不存在的情況下，在溶劑中，加熱后將香根草精油或香根草精油輕餾分與醋酸酐進(jìn)行乙酰化而獲得，并歸類(lèi)為合成成分。

利用南極洲假絲酵母脂肪酶B的大底物混雜性，以天然乙酸乙酯為溶劑和?；w，通過(guò)酶乙酰化制備了香根草乙酸酯。[53]在這一過(guò)程中，由于所用的酶固定在丙烯酸樹(shù)脂上，可循環(huán)使用12次以上，且活性幾乎沒(méi)有下降，因此獲得了非常高的可持續(xù)性，使用生物基乙酸乙酯并在蒸發(fā)后循環(huán)使用，反應(yīng)在室溫下幾小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。因此，首次以定量產(chǎn)量和千克規(guī)模生產(chǎn)出95%以上的天然乙酸香根草酯。有趣的是，詳細(xì)全面的GCxGC-MS表明，該反應(yīng)與伯倍半萜醇發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)，留下的仲醇和叔醇大部分保持不變。

橡苔凈油Oakmoss absolute

橡苔凈油是地衣橡苔(Evernia prunastri)的溶劑提取物，也是一種天然原料，近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，在素心蘭和馥奇香韻中一直用于制作精細(xì)香料。[54]橡苔凈油主要由單芳香化合物和縮酚酸類(lèi)化合物組成，含有少量接觸性過(guò)敏原苔黑醛和氯化苔黑醛。2017年8月2日歐盟（EU）委員會(huì)第2017/1410號(hào)條例規(guī)定，自2021 8月23日起，不得在歐盟市場(chǎng)上提供含有這些物質(zhì)的化妝品。[11]

根據(jù)我們之前對(duì)丁香酚的研究，我們開(kāi)發(fā)了一種基于過(guò)氧化物酶的策略，專(zhuān)門(mén)從橡苔凈油中去苔黑醛和氯化苔黑醛。[56]連續(xù)過(guò)程中的反應(yīng)是，兩種芳香醛在pH為9的條件下通過(guò)過(guò)氧化氫進(jìn)行Dakin氧化，然后在同一罐中通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶HRP催化產(chǎn)生的鄰苯三酚衍生物進(jìn)行氧化偶聯(lián)（方案9）。在這些氧化條件下，提出了一種由酶氧化開(kāi)始的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以解釋所形成產(chǎn)物的復(fù)雜性。[56a]該產(chǎn)品為水溶性產(chǎn)品，可通過(guò)液-液萃取簡(jiǎn)單地從凈油中去除。

結(jié)果顯示，改良后的橡苔凈油中的苔黑醛和氯化苔黑醛含量?jī)H為ppm。通過(guò)對(duì)56人的小組進(jìn)行三角測(cè)試進(jìn)行感官分析，結(jié)果表明，在99%置信水平下，無(wú)苔黑醛的凈油從嗅覺(jué)角度來(lái)看，與真實(shí)凈油沒(méi)有顯著差異。

方案9. 苔黑醛氧化為5-甲基鄰苯三酚，通過(guò)HRP觸發(fā)的氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成稠合二聚體。

可持續(xù)性和天然性

生物催化是“自然”可持續(xù)的。[57]這不僅是因?yàn)榉磻?yīng)是在水中進(jìn)行的（而且在下游加工過(guò)程中有時(shí)需要溶劑來(lái)收集產(chǎn)品），而且是在接近室溫的溫度下進(jìn)行的，還有許多其他方面的原因?？紤]到著名的12條原則所指的綠色和可持續(xù)化學(xué)的4個(gè)主要項(xiàng)目，[58]可以列出以下可持續(xù)性應(yīng)用生物催化的資產(chǎn)：

廢物預(yù)防

-高選擇性，僅提供所需產(chǎn)品（副產(chǎn)品較少）；

-高對(duì)映選擇性，能夠僅提供活性立體異構(gòu)體，包括對(duì)映體重要的情況。這在芳香化學(xué)中尤其重要，因?yàn)槭中院苤匾?，可能?huì)對(duì)氣味分子的性質(zhì)產(chǎn)生定性和定量的影響；[59]

-節(jié)約型，生物催化過(guò)程在添加劑、活化劑、保護(hù)基團(tuán)等方面的有限要求，主要?dú)w功于酶的高度特異性；

-天然等同分子的生物降解性，其降解生物化學(xué)級(jí)聯(lián)已經(jīng)存在或很容易被活生物體激活。

資源

-使用的酶是穩(wěn)定的可再生生物催化劑，而不是石化化學(xué)試劑，因此消耗資源，有時(shí)保質(zhì)期有限；

-當(dāng)估計(jì)生物量的50%由碳水化合物組成時(shí)，葡萄糖可以用作碳源；

-通常從天然基質(zhì)或生物基質(zhì)開(kāi)始。

安全

-水作為一種不易燃、無(wú)毒的溶劑，不存在放大的風(fēng)險(xiǎn)。然而，工業(yè)廢水在排放前需要進(jìn)行處理，主要是為了去除微生物病原體和重金屬。

-很少需要外部安全；

-除過(guò)敏性外，在處理過(guò)程中或接觸時(shí)，酶不被視為有害物質(zhì)；

-無(wú)需特殊安全工藝的高壓/高溫、自燃或含能材料。

有限的監(jiān)督

-使用生物技術(shù)方法去除被標(biāo)記為健康問(wèn)題的特定管制化合物可以提高投放市場(chǎng)的產(chǎn)品的安全性。

有力的節(jié)制

-室溫工藝，意味著沒(méi)有加熱或冷卻，這在工業(yè)上是昂貴的操作。

度量標(biāo)準(zhǔn)

用單一指標(biāo)衡量所有這些因素和影響并非易事。一般來(lái)說(shuō)，考慮同質(zhì)的影響組，并以相對(duì)方法而非絕對(duì)方法比較成分或過(guò)程，更方便、更具洞察力。[61]一些倡議在行業(yè)內(nèi)蓬勃發(fā)展，以在其活動(dòng)中實(shí)施和衡量可持續(xù)性，或多或少側(cè)重于與綠色化學(xué)直接相關(guān)的概念。法國(guó)Mane et fils公司在2010年初開(kāi)發(fā)了綠色運(yùn)動(dòng)指標(biāo)[62]，該指標(biāo)基于0-100分制的對(duì)制造成分的健康、安全和環(huán)境影響的評(píng)估。

在法國(guó)，創(chuàng)新集群PASS（現(xiàn)為Innov'Alliance）于2018年與香料行業(yè)的12家公司建立了生態(tài)責(zé)任成分標(biāo)簽（ERI-360）。[63]通過(guò)對(duì)農(nóng)業(yè)和制造過(guò)程以及社會(huì)方面的分析，可以將標(biāo)簽歸因于不同程度的生態(tài)責(zé)任。2018年，德之馨開(kāi)發(fā)了產(chǎn)品可持續(xù)性記分卡，以評(píng)估其解決方案的可持續(xù)性[64]和IFF“邁向循環(huán)未來(lái)”計(jì)劃。[65]

2019年，奇華頓啟動(dòng)了“五碳之路”(FiveCarbon Path?)，作為“明天感”計(jì)劃的一部分，旨在增加可再生碳的使用，提高合成中的碳效率，最大限度地提高可生物降解碳，使用高抗沖擊材料提高“每碳?xì)馕侗取保⑹褂脕?lái)自側(cè)流的向上循環(huán)的碳。[66]

繼2018年推出“生態(tài)氣味指南”(EcoScent Compass)之后，芬美意公司宣布于2020年6月推出“生態(tài)成分指南”(EcoComponent Compass)，這是一種新的專(zhuān)有工具，用于即時(shí)評(píng)估芳香分子的可再生碳、生物降解性和綠色化學(xué)。[67]

社會(huì)

綠色化學(xué)的十二項(xiàng)原則并沒(méi)有真正解決社會(huì)影響，除了作為安全問(wèn)題在全球范圍內(nèi)解決的健康問(wèn)題。生物多樣性可能因大量消耗特定的植物或動(dòng)物資源而受到威脅。如果出于道德原因，動(dòng)物源性成分如今很少使用，那么一些珍貴的有氣味的木材，在過(guò)去幾十年中被大量開(kāi)發(fā)，現(xiàn)在已被置于國(guó)際公約（如CITES）的保護(hù)之下，以避免其滅絕。消費(fèi)者可能對(duì)其生活方式的這些類(lèi)型的影響很敏感。

代謝工程和合成生物學(xué)等新技術(shù)對(duì)非洲或其他地方發(fā)展中國(guó)家財(cái)富的影響是一些非政府組織關(guān)注的問(wèn)題。[68]例如，香草種植和出口是馬達(dá)加斯加的重要經(jīng)濟(jì)資產(chǎn)，2018年占全球香草總市場(chǎng)的62%。香精香料行業(yè)的大多數(shù)大公司在可持續(xù)發(fā)展計(jì)劃中都考慮到了這一點(diǎn)，以同時(shí)提高農(nóng)民收入和農(nóng)業(yè)實(shí)踐。2020年夏季，IFRA和IOFI發(fā)布了IFRA-IOFI可持續(xù)發(fā)展憲章。[69]

經(jīng)濟(jì)可行性

與傳統(tǒng)工藝相比，白色生物技術(shù)工藝的經(jīng)濟(jì)可行性問(wèn)題是合理的，尤其是在產(chǎn)品濃度和生產(chǎn)率較低的情況下，并且在評(píng)估其工業(yè)實(shí)施情況時(shí)始終至關(guān)重要。[70]

對(duì)于商品化學(xué)品，銷(xiāo)售價(jià)格取決于原油價(jià)格的變化，[71]對(duì)于包括香料成分在內(nèi)的精細(xì)化學(xué)品，則取決于關(guān)鍵中間體的短缺問(wèn)題。[72]

如果我們考慮工業(yè)生物技術(shù)可行性的一般方面，我們可以大致按增值過(guò)程遞減順序確定3類(lèi)化學(xué)品：原料藥、精細(xì)化學(xué)品、中間體和商品。在過(guò)去二十年中，工業(yè)上越來(lái)越多地實(shí)施生物技術(shù)工藝，最終產(chǎn)生了非常有價(jià)值的手性原料藥，如西他列汀[73]（在優(yōu)化的最終工藝中，酶可以耐受200g/L濃度的底物），總收率提高（13?%）和生產(chǎn)力（53?%）與化學(xué)過(guò)程（過(guò)渡金屬基不對(duì)稱(chēng)催化）相比。研究了生物基商品的最低售價(jià)（MSP），并確定與傳統(tǒng)的石化生產(chǎn)工藝相比，有效量≥45g/L可降低生產(chǎn)成本、能耗和溫室氣體排放。[74]

在香精成分的特殊情況下，它取決于成分和策略，當(dāng)一種成分可以保持受控狀態(tài)時(shí)（非商用，僅用于擁有它的香料公司的香水成分中，并用作識(shí)別標(biāo)志）。在某些特定情況下，它還取決于天然成分價(jià)格的變化。

天然性

從孟德?tīng)柕娜斯ぶ参镫s交[75]到代謝工程和分子工具的基因選擇和編輯[76]，我們應(yīng)該如何根據(jù)科學(xué)輸入定義自然性？這些領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)展，通過(guò)實(shí)施組學(xué)、硅模擬和深度學(xué)習(xí)算法，加快生物成分的選擇、組裝和協(xié)調(diào)，以實(shí)現(xiàn)從廉價(jià)元素來(lái)源生物合成有價(jià)值的化學(xué)品。另一方面，消費(fèi)者認(rèn)為精油是高度天然的物質(zhì)，盡管在潮濕條件下100°C加熱萜烯是進(jìn)行水合、脫水和異構(gòu)化反應(yīng)等的合適方式。人工的定義更簡(jiǎn)單：在自然界中從未見(jiàn)過(guò)，因此是由人類(lèi)大腦設(shè)計(jì)的。然而，如果一種化合物后來(lái)在自然界中被發(fā)現(xiàn)，那么它的人工狀態(tài)可能會(huì)發(fā)生變化。自然界中相同的分子應(yīng)該享有特殊的地位，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖x組中的存在具有進(jìn)化的合理性，并且因?yàn)樽匀唤缰廊绾翁幚磉@些分子，并最終處理這些分子。

自然界中未知但在涉及轉(zhuǎn)基因的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的分子的狀態(tài)仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。盡管經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因改性，但轉(zhuǎn)基因生物仍然是活的有機(jī)體，其任何代謝產(chǎn)物都應(yīng)被視為天然產(chǎn)物。Clearwood?和Akigalawood?等成分是臨界物質(zhì)的很好例子，可以它們的自然性被證明。前者由轉(zhuǎn)基因活生物體制成，但產(chǎn)生了自然界其他地方從未見(jiàn)過(guò)的代謝物；后者是一種人造成分，使用酶從天然原料制備而成，雖然天然，但幾乎不應(yīng)將其視為活的生物體。由于具有幾乎無(wú)限的能力來(lái)改變細(xì)菌宿主的代謝，這最終意味著任何分子都應(yīng)該是白色生物技術(shù)“天然”制造的，因此“天然分子”一詞將失去意義。擠壓柑橘類(lèi)水果并聞其氣味可能是聞到真正天然氣味的最可靠方法。

觀點(diǎn)

生物技術(shù)工藝在香料行業(yè)的應(yīng)用以及最近推出的香料成分的成功無(wú)疑表明，該領(lǐng)域在未來(lái)將繼續(xù)增長(zhǎng)。這些方法不僅積極平衡了世界偏遠(yuǎn)地區(qū)生產(chǎn)的原材料供應(yīng)問(wèn)題，有時(shí)還受到外部因素（氣候變化、自然災(zāi)害、政治變化、短缺……）的影響，但這些工藝也符合對(duì)可持續(xù)成分和工藝日益增長(zhǎng)的需求。如果這些高科技的基因科學(xué)操作似乎保留給大公司，那么用于轉(zhuǎn)移、表達(dá)和純化的基因編輯工具和配件的普及必將在不久的將來(lái)允許在該領(lǐng)域得到更大的應(yīng)用。專(zhuān)門(mén)從事這類(lèi)活動(dòng)的小公司也在這方面與F&F公司建立了合資企業(yè)。

在Gingko生物工程提交的上述專(zhuān)利中，通過(guò)選擇稀有或已滅絕植物DNA中的部分基因構(gòu)建了嵌合萜烯合成酶。[18] 這種方法可能導(dǎo)致前所未有的生物合成步驟組合，從而產(chǎn)生新的倍半萜結(jié)構(gòu)或倍半萜衍生物的原始混合物。

然而，轉(zhuǎn)基因生物的問(wèn)題對(duì)某些企業(yè)和產(chǎn)品仍然很敏感，一些終端消費(fèi)者不愿意接觸轉(zhuǎn)基因生物或通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因生物獲得的產(chǎn)品，有時(shí)對(duì)實(shí)際發(fā)生的事情缺乏了解。此外，在環(huán)境中意外釋放的轉(zhuǎn)基因生物可能會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生無(wú)法控制的影響。這個(gè)問(wèn)題必將影響代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的未來(lái)。另一種解決方案是使用野生酶，即使研發(fā)和開(kāi)發(fā)階段仍然可以使用異源表達(dá)產(chǎn)生的酶，并使用外部方法而不是基因操作來(lái)達(dá)到目標(biāo)反應(yīng)性：底物濫交、催化濫交和媒介濫交，研究實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究了多年。[52, 77]

生物技術(shù)可以與更好地理解人類(lèi)嗅覺(jué)系統(tǒng)一起使用，通過(guò)刺激大約400個(gè)人類(lèi)嗅覺(jué)受體來(lái)重建自然香氣特征。[78]

考慮到自然性的難以定義，在未來(lái)可能僅限于未加工物質(zhì)，因此不應(yīng)低估監(jiān)管機(jī)構(gòu)在這一領(lǐng)域的影響。